Deteccion de ARN Mensajeros (ARNm) Constitutivos y Relacionados con Estres Oxidativo en Bovinos y Ovinos

Abstract

Introducción. El perfil de transcritos mensajeros (ARNm) de rumiantes tiene aplicaciones biomédicas y biotecnológicas. El objetivo fue amplificar por PCR punto-final secuencias (obtener amplicones) correspondientes a transcritos bovinos y ovinos constitutivos y relacionados con estrés oxidativo. Materiales y Métodos. Se obtuvieron ovarios bovinos de rastro y sangre ovina por punción venosa. Se diseccionó el epitelio ovárico bovino, se congeló con nitrógeno líquido y se homogenizó con mortero/jeringa-aguja. El ARN ovárico se extrajo con columna de sílica. Se extrajo ARN total sanguíneo ovino mediante red blood lysis buffer (enriquece el material leucocitario) /fenol-guanidino (Liu et al., 2015). Ambos ARNs se resuspendieron en H2O/DEPC, se cuantificaron espectrofotométricamente (A260) y su pureza se verificó (A260/280). Se retrotranscribió con oligo(dT) y se verificó la concentración y pureza del ADN copia (ADNc). Los primers para transcritos constitutivos y relacionados con estrés oxidativo se diseñaron con PrimerQuest, con parámetros que permiten generar amplicones por PCR punto-final y cuantificarlos por PCR tiempo-real. Alternativamente, las secuencias de los primers se obtuvieron de la literatura. Se realizó PCR punto-final. El tamaño de los amplicones se verificó en gel de agarosa/EtBr. Los amplicones se purificaron (columna de sílica) y se envió a secuenciar su ADN. Las secuenciaciones se analizaron por BLASTn/refseq_rna para bovino u ovino (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Resultados y Discusión. Se obtuvieron por PCR punto-final amplicones del tamaño esperado (102-287 pb) para los transcritos correspondientes de rumiante. La especificidad de la secuencia se corroboró mínimo en un amplicón para cada transcrito correspondiente. Por tanto, se detectaron por PCR punto-final transcritos constitutivos (bovino: ACTB, CHUK, B2M, MYL6, PPIA; ovino: YWHAZ) y relacionados con estrés oxidativo (bovino: DJ-1, KEAP1, PINK1; ovino: DJ-1; nuevo reporte experimental aquí). Dado el diseño de los primers, como los resultados de PCR punto-final, estos primers serán la base para analizar los transcritos correspondientes por PCR tiempo-real (Ponchel et al., 2003). Conclusiones. Se detectaron, mediante PCR punto-final, transcritos constitutivos y relacionados con estrés oxidativo en muestras ováricas y sanguíneas bovinas y ovinas, respectivamente. Esta estrategia servirá como base para PCR tiempo-real de dichos transcritos en todo tipo celular bovino y ovino, con potencial para la comprensión de su fisiología, o en aplicaciones biomédicas, biotecnológicas y de producción animal en estas especies. Referencias Bibliográficas Liu et al. (2015). Comparison of six different pretreatment methods for blood RNA extraction. Biopreserv Biobank. 13:56–60. Ponchel et al. (2003). Real-time PCR based on SYBR-Green I fluorescence: An alternative to the TaqMan assay for a relative quantification of gene rearrangements, gene amplifications and micro gene deletions. BMC Biotechnol. 3:18. National Center for Biotechnology Information, NCBI (2022). Basic Local Alignment Search Tool (BLAST). https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (consultado: 13/08/2022).